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GLP-1藥物雜質(zhì)鑒定困難，一維去鹽LC-MS提供完美解決方案

發(fā)布時(shí)間：

2024-05-27

作者：

晨辰醫(yī)藥

來(lái)源：

晨辰醫(yī)藥公眾號(hào)

近年來(lái)，司美格魯肽與替爾泊肽等GLP-1多肽藥物取得了巨大成功，成為糖尿病和減重治療的“明星藥品”。讓人驚喜的是，多項(xiàng)臨床研究及科研報(bào)道表明，GLP-1多肽藥物還具有降壓、改善血脂以及保護(hù)心血管和腎臟等諸多作用，具有成為萬(wàn)能神藥的潛力。獨(dú)特的臨床療效讓多肽藥物正成為越來(lái)越重要的藥物類別和研發(fā)熱點(diǎn)。雜質(zhì)是藥品最為關(guān)鍵的質(zhì)量屬性，雜質(zhì)鑒定是多肽藥物研發(fā)過(guò)程中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。針對(duì)多肽類藥物的雜質(zhì)鑒定存在的困難，長(zhǎng)沙晨辰醫(yī)藥提出了一維在線除鹽LC-MS技術(shù)方案，并證明其能很好地應(yīng)用于GLP-1多肽類藥物雜質(zhì)的快速準(zhǔn)確鑒定。

二維去鹽LC-MS針對(duì)多肽藥物雜質(zhì)研究存在的痛點(diǎn)

近些年來(lái)，質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，QE及Q-TOF等儀器能提供高質(zhì)量的一級(jí)與二級(jí)高分辨率質(zhì)譜數(shù)據(jù)，能幫助快速準(zhǔn)確鑒定藥物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。然而，多肽藥物有關(guān)物質(zhì)分析方法多采用含磷酸鹽、離子對(duì)等的RP-HPLC方法，不能直接進(jìn)質(zhì)譜儀分析。為了解決含鹽方法與質(zhì)譜不兼容問(wèn)題，各大儀器廠家都已推出了基于閥切換的二維去鹽LC-MS技術(shù)及配套儀器設(shè)備。二維去鹽LC-MS能解決部分含鹽HPLC方法質(zhì)譜分析問(wèn)題，但針對(duì)多肽類雜質(zhì)的質(zhì)譜鑒定依然困難重重。多肽類藥物雜質(zhì)數(shù)量眾多，且其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與主成分往往較為相似，有關(guān)物質(zhì)分析方法難以實(shí)現(xiàn)主峰與各個(gè)雜質(zhì)及各雜質(zhì)間充分分離，基于閥切換的二維去鹽LC-MS難以切到干凈的目標(biāo)雜質(zhì)峰流分，所得到的第二維LC-MS譜圖往往具有多個(gè)組分的MS信號(hào)，從而導(dǎo)致無(wú)法正確判斷哪個(gè)是目標(biāo)雜質(zhì)的MS信號(hào)。另外，二維去鹽LC-MS還存在其它多個(gè)缺陷，比如切峰時(shí)會(huì)有嚴(yán)重流分損失導(dǎo)致靈敏度低；第二維HPLC方法常使用大梯度方法，且一般使用與質(zhì)譜兼容但背景高的甲酸，會(huì)導(dǎo)致背景高、鬼峰多、目標(biāo)雜質(zhì)峰識(shí)別困難；當(dāng)有多個(gè)雜質(zhì)峰需要MS鑒定時(shí)，二維切峰工作量大，效率低。

一維在線除鹽LC-MS能完美應(yīng)用于多肽藥物雜質(zhì)研究

圖1，長(zhǎng)沙晨辰醫(yī)藥搭建的一維在線除鹽LC-MS技術(shù)原理示意圖

針對(duì)在線二維LC-MS方法在多肽藥物雜質(zhì)研究存在的缺點(diǎn)，長(zhǎng)沙晨辰醫(yī)藥開(kāi)發(fā)出了一維在線除鹽LC-MS技術(shù)，并在實(shí)驗(yàn)室搭建了多套基于QE及Q-TOF等高分辨質(zhì)譜的一維在線去鹽LC-HRMS/MS系統(tǒng)。一維在線除鹽LC- MS技術(shù)原理如圖1所示，即在HPLC流路進(jìn)入質(zhì)譜離子源之前相繼接了一個(gè)陰離子抑制器和陽(yáng)離子抑制器，能在線去除小分子量的陰離子和陽(yáng)離子，從而實(shí)現(xiàn)含鹽HPLC方法直接質(zhì)譜分析。一維在線除鹽相當(dāng)于是HPLC與質(zhì)譜直接相連，HPLC的UV色譜圖與質(zhì)譜的總離子流圖完全對(duì)應(yīng)，因此能準(zhǔn)確識(shí)目標(biāo)雜質(zhì)的質(zhì)譜信號(hào)。當(dāng)然，一維去鹽LC- MS也存在應(yīng)用局限，目標(biāo)雜質(zhì)在流動(dòng)相中可能會(huì)電離，因而也有被抑制器在線去除的風(fēng)險(xiǎn)。為了規(guī)避該風(fēng)險(xiǎn)，晨辰醫(yī)藥搭建的在線去鹽裝置具有分子量選擇性，電離物質(zhì)分子量越小越容易去除，分子量越大越不容易去除。多肽類藥物及其雜質(zhì)一般分子量較大，在線去鹽裝置對(duì)其完全沒(méi)有傷害。因此，晨辰醫(yī)藥開(kāi)發(fā)的一維在線去鹽LC-HRMS/MS技術(shù)能完美地匹配多肽含不揮發(fā)鹽有關(guān)物質(zhì)方法的LC-MS鑒定分析。

高分辨率質(zhì)譜解析算法軟件

多肽等生物大分子的質(zhì)譜數(shù)據(jù)比小分子復(fù)雜得多，通常需要利用計(jì)算機(jī)算法和軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，從而獲得生物大分子的結(jié)構(gòu)信息，這是多肽藥物雜質(zhì)質(zhì)譜分析的難點(diǎn)。晨辰醫(yī)藥算法團(tuán)隊(duì)利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法對(duì)大量真實(shí)多肽藥物雜質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，開(kāi)發(fā)出多肽藥物雜質(zhì)理論質(zhì)譜圖譜算法和新的肽圖比對(duì)機(jī)制，可直接對(duì)未知多肽雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析，準(zhǔn)確獲取相應(yīng)的結(jié)構(gòu)信息。利用該算法，能成功對(duì)各類多肽藥物的缺失肽、插入肽、錯(cuò)結(jié)肽等雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

一維在線除鹽LC-HRMS/MS在多肽藥物雜質(zhì)研究應(yīng)用案例分析

替爾泊肽原料藥中未知雜質(zhì)鑒定

客戶替爾泊肽有關(guān)物質(zhì)方法含有磷酸鹽，與質(zhì)譜不兼容，主峰前后有4個(gè)雜質(zhì)明顯檢出，客戶曾嘗試過(guò)使用二維去鹽LC-MS鑒定雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，但以失敗告終。長(zhǎng)沙晨辰醫(yī)藥接受客戶的委托后，使用一維去鹽LC-MS對(duì)該4個(gè)雜質(zhì)成功進(jìn)行了鑒定。

圖2，一維在線除鹽LC-HRMS/MS下的HPLC-UV圖和TIC圖

圖2為替爾泊肽含鹽有關(guān)物質(zhì)方法HPLC-UV色譜圖及通過(guò)一維去鹽直接進(jìn)QE質(zhì)譜分析所得到的TIC譜圖。UV色譜圖與相應(yīng)TIC譜圖各雜質(zhì)峰完全一一對(duì)應(yīng)，從而能準(zhǔn)確無(wú)誤地獲得各雜質(zhì)的一級(jí)與二級(jí)高分辨率質(zhì)譜圖。采用高分辨率質(zhì)譜解析算法軟件對(duì)四個(gè)目標(biāo)雜質(zhì)的一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行解析，最終鑒定出了4個(gè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。圖3為雜質(zhì)A和雜質(zhì)C的肽序及b、y離子鑒定結(jié)果；雜質(zhì)B與D也成功得以鑒定，分別為取代肽與插入肽雜質(zhì)，但出于對(duì)客戶的保密性要求，本推文未展示結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)。