樣品前處理或溶液配制過程引起主化合物和雜質(zhì)的流失

有些產(chǎn)品在樣品前處理過程中會引發(fā)部分揮發(fā)性雜質(zhì)的流失，或在溶劑提取過程中出現(xiàn)難溶性雜質(zhì)與輔料結(jié)合導(dǎo)致未被完全提取的情況（如一些雜質(zhì)與輔料發(fā)生螯合），或溶液配制過程中過濾操作導(dǎo)致雜質(zhì)吸附性損失?？刹捎萌缦路椒ù_定和排除上述因素：

1）樣品前處理過程中規(guī)避研磨操作，考察研磨和非研磨操作處理樣品得到的檢測結(jié)果差異，如差異性較大則尋求合適的研磨環(huán)境及條件。

2）更換提取能力更強的稀釋劑，增加稀釋劑提取能力，并將前后的考察結(jié)果進行比較。比如懷疑樣品中有雜質(zhì)可能與含金屬離子的輔料發(fā)生螯合時，可嘗試在稀釋劑中添加少量金屬螯合劑，減少雜質(zhì)與輔料的螯合。

3）采用離心替換過濾，避免待測物的吸附性損失。

主化合物和雜質(zhì)在樣品基質(zhì)、包裝材料、硬件設(shè)施中丟失或被吸附

在某些情況下，由于不溶性、揮發(fā)性或吸附損失，主化合物和雜質(zhì)會從檢測樣品中被除掉?？刹捎萌缦路椒ù_定和排除上述因素：

1）不溶性的問題一般采用目視觀察或濁度檢測可能會發(fā)現(xiàn)。曾進行某個堿性原料藥的強制降解，由于該原料藥在堿性環(huán)境中不易溶解，在酸堿破壞試驗過程中，在終止破壞時即進行酸堿中和時只要溶液體系加的堿溶液稍微過量，就出現(xiàn)主化合物以透明液態(tài)顆粒的形態(tài)析出，析出物不太明顯，定容時未留意有不溶性物質(zhì)，導(dǎo)致出現(xiàn)了質(zhì)量不守恒。這種情況下，向體系中增加一點點的酸助溶，解決了主化合物析出的問題。

2）如果降解產(chǎn)物中含有揮發(fā)性雜質(zhì)，如某些β-內(nèi)酰胺類化合物在高熱條件下下易降解出一些氣體雜質(zhì)，高溫試驗時采用可承受膨脹且可觀察的密封的包裝方式（如用鋁箔袋進行密封）進行試驗，完成破壞后如發(fā)現(xiàn)包裝袋發(fā)生膨脹，基本可確認降解雜質(zhì)中含有氣體。這種情況下采用供試品溶液進行高溫破壞可能更加合適，避免或減少了氣體降解雜質(zhì)的產(chǎn)生；或設(shè)計試驗讓降解在較低溫下產(chǎn)生使樣品保持低溫以最小化揮發(fā)性。如實在無法避免氣體降解雜質(zhì)，可考慮以頂空方式捕獲降解樣品。

3）主化合物和雜質(zhì)有時候可能會吸附在輔料和包裝容器中，在研究過程中可嘗試使用溶解性能更好的溶劑對輔料和包裝容器進行提取，考察提取液中是否檢測到主化合物和雜質(zhì)。在質(zhì)量研究初期，應(yīng)對包材的選擇進行全面的研究，考察不同的包裝方式對產(chǎn)品的影響，盡量避免或減少吸附。

4）少數(shù)情況下，降解產(chǎn)物與色譜柱填料發(fā)生反應(yīng)在色譜柱上產(chǎn)生了死吸附，導(dǎo)致雜質(zhì)檢出量降低，質(zhì)量不守恒。因與填料發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生的死吸附一般很難沖洗出來，即使增大分析方法洗脫能力也未見良好的效果。這種死吸附往往容易破壞柱床，長久進此類破壞樣品會伴隨著柱效與柱壓的改變。欲確認是否發(fā)生死吸附，可使用不接色譜柱分析破壞樣品，如嘗試使用雙通或長毛細管柱代替色譜柱，將獲得的總峰面積與使用色譜柱時獲得的總峰面積進行比較。這種診斷方式的潛在困難是不接色譜柱時所有化合物均無保留，一般會形成一個無保留的峰，且這個峰易受溶解樣品溶劑的影響，若溶劑與流動相有很大不同，則溶劑對樣品響應(yīng)的影響可能會使在沒有色譜柱的情況下難以進行準確的積分。這種情況可將待測溶液用流動相進行適當?shù)南♂?，避免產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，同時能避免色譜峰發(fā)生過載導(dǎo)致定量不準確。如果在接色譜柱時獲得的總峰面積明顯小于不接色譜柱時的總峰面積，則HPLC方法中存在一些雜質(zhì)與色譜柱發(fā)生了死吸附，當發(fā)生死吸附時實驗員應(yīng)考慮更換分離體系。

分析方法的局限性和不適用性

檢測方法不適用是質(zhì)量不守恒中的常見因素之一，表現(xiàn)為未能建立合適的檢測方法檢出所有的降解產(chǎn)物，使主成分降解后測定的回收量偏低，如降解為無紫外吸收的小分子物質(zhì)（現(xiàn)有方法檢測器檢測不到），或形成極性小的聚合物（現(xiàn)有方法沒有洗脫出來），或降解產(chǎn)物在現(xiàn)有方法波長下與主峰響應(yīng)因子差異大導(dǎo)致定量不準確，或降解產(chǎn)物與主峰共洗脫（雜質(zhì)被包裹在主峰內(nèi)，兩者響應(yīng)不一致時可影響質(zhì)量守恒計算），或降解產(chǎn)物與溶劑峰、輔料峰共洗脫（雜質(zhì)被包裹，直接被去除積分）。

針對上述問題，解決方案如下：

1）降解產(chǎn)物沒有紫外吸收，檢測器檢測不到

紫外吸收光譜是由于分子中價電子（含形成單鍵σ電子、形成不飽和鍵的π電子、未參與成鍵的n電子）的躍遷而產(chǎn)生的，藥學(xué)研究中的紫外吸收一般由π→π*或n→π*躍遷（主要在200~400nm之間有吸收）產(chǎn)生。當降解產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)中未含有π電子的基團時，檢測器即有可能檢測不到這些降解產(chǎn)物。這種情況下，常使用更低的波長或使用其他檢測器（例如質(zhì)譜法（MS）、帶電氣溶膠檢測（CAD）、蒸發(fā)光散射檢測（ELSD）、或火焰電離檢測（FID）等），考察不同檢測器類型下破壞樣品的雜質(zhì)分布情況，確認或排除該因素的影響。如降解產(chǎn)物中出現(xiàn)比較大量的無紫外吸收的雜質(zhì)，實驗員可考慮更換更適宜的檢測器對破壞樣品進行檢測。

在研發(fā)工作中曾遇到一抗菌藥物質(zhì)量不守恒的案例，該案例中主化合物分子結(jié)構(gòu)中硝基咪唑環(huán)上連接的側(cè)鏈均為飽和基團，產(chǎn)生的躍遷類型為σ→σ*躍遷（吸收一般在小于150nm的遠紫外區(qū)）和n→σ*躍遷（吸收一般在小于200nm的遠紫外區(qū)），在進行強制降解過程中發(fā)生了強破壞樣品出現(xiàn)嚴重質(zhì)量不守恒現(xiàn)象。在進行研究時從主化合物分子結(jié)構(gòu)進行分析，該藥物在發(fā)生降解時，硝唑環(huán)的降解可能會產(chǎn)生一些沒有生色團、無明顯紫外吸收的降解雜質(zhì)?；谏鲜龅睦碚摲治鰧⒃摦a(chǎn)品的破壞樣品進行液相質(zhì)譜聯(lián)用分析，對比破壞樣品的紫外信號及質(zhì)譜信號，如下圖3-1。

圖 3-1

圖 3-2

圖 3-4

降解產(chǎn)物復(fù)雜性或色譜柱性能不良導(dǎo)致積分不準確

有些情況下，當藥品尤其是液體制劑藥品在發(fā)生比較復(fù)雜的降解（如降解劇烈導(dǎo)致雜質(zhì)種類眾多或發(fā)生多級降解）時，盡管它們可能從HPLC色譜柱上洗脫下來，但會在有關(guān)物質(zhì)圖譜中以鼓包、駝峰、寬峰或扁平峰的形式存在，甚至不成峰型或不會顯示出離散的峰而是基線升高，此類雜質(zhì)很容易被“遺漏”并保持未積分狀態(tài)。運行空白對于確定基線升高是來自樣品還是屬于色譜假象，非常有幫助。在進行某注射液強制降解樣品的不守恒研究時，發(fā)現(xiàn)其高溫破壞樣品有關(guān)物質(zhì)檢測時以一個寬峰、鼓包的形式存在（如圖4-1），當放置的溫度越高放置時間越長，鼓包越明顯。

圖 4-1

在通過制備分離獲得該“鼓包”后，通過高分辨質(zhì)譜、核磁共振氫譜確認該“鼓包”為多種化合物組成的混合物，而在常規(guī)積分模式中這種鼓包峰是沒有被積分的。此時就需要采用特殊的積分處理手段，重新考察質(zhì)量守恒值，最終物料達到了平衡。

針對這種降解產(chǎn)物復(fù)雜形成的鼓包峰，建議在研究過程先嘗試解析出“鼓包化合物”的可能結(jié)構(gòu)，通過質(zhì)譜、核磁和紫外考察降解雜質(zhì)的特點，進而選擇合適的手段對這類降解雜質(zhì)進行控制。比如，針對圖4.1中的高溫樣品中的鼓包雜質(zhì)，在研究過程中從鼓包上不同位置分別提取了紫外吸收光譜，發(fā)現(xiàn)不同位置上雜質(zhì)具有一定相關(guān)性，且主要在高波段（580nm~800nm）都產(chǎn)生了吸收，在低波段處的紫外走向則不完全相同，說明了引起鼓包的為混合物，是由多個相似結(jié)構(gòu)的化合物組成的，這些化合物存在極性差異，最終在色譜圖上以一個大的寬峰的形式體現(xiàn)出來，這種情況可通過其它特殊的方式對該類雜質(zhì)進行控制。